सेल सिंक्रोनाइज़ेशन विधियाँ

G1 की गिरफ्तारी

डबल टिमिडीन ब्लॉक, सेरम भूखा है। साइक्लिन डिपेंडेंट किनाज़ (CDK) का निषेध

G2 की गिरफ्तारी

माइक्रो ट्यूबल्स की रोकथाम, साइक्लिन डिपेंडेंट किनाज़ (CDK)

G2/M की गिरफ्तारी

RO-3306

M-चरण

टैक्सोल, नोकोडाज़ोल

1.

G1/S सीमा पर कोशिकाओं को तुल्यकालित करने के लिए एक ताजा तैयार टिमिडीन घोल (16 mM) को एक 0.22 µm फिल्टर डिस्क का उपयोग करके संपूर्ण माध्यम और फ़िल्टर-sterilized किया गया था.

2.

कोशिकाओं (1 X 10⁷) को 60 ml का संपूर्ण माध्यम जो कि टिमिडीन (2 mM) में १६ घंटे के लिए १७५ cm³ सेल संवर्धन के शीशे में संवर्धित किया गया था।

3.

कोशिकाओं को फिर से सेल चक्र में फिर से प्रवेश करने के लिए 8 घंटे के लिए पूरी तरह से मध्यम (52, 5 ml) में फिर से निलंबित किया गया।

4.

कोशिकाओं को केंद्रन द्वारा ५ मिनट के लिए 400 x g पर काटा गया और X 2 को पूर्ण माध्यम में (10 ml) में धोया गया। जी1/एस सीमा पर कोशिकाओं को 16 घंटे के लिए टिमिडीन (2mM) युक्त 60 ml का संपूर्ण माध्यम में संवर्धित किया गया

5.

सेल तुल्यकालन फ्लो साइटॉमिति द्वारा पुष्टि की गई थी

1.

समसूत्रण में कोशिकाओं (1 x 10⁷) को नोकोडाज़ोल (100 nM) के साथ 18 घंटे तक उपचार करके और 175 cm² में 37 °C पर incubation किया गया था।

2.

कोशिकाओं को संपूर्ण मध्यम X3 से धोया गया और संपूर्ण मध्यम में फिर से प्लाट किया गया और नमूने को 0, 30, 60, 120 और 180 मिनट के बाद निकाला गया।

3.

नियंत्रण के तौर पर, समसूत्र में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए नोकोडाज़ोल (100 nM) की उपस्थिति में एक नमूना फिर से प्लेट किया गया और नमूना को रिहाई के बाद 180 मिनट लिया गया।

4.

RIPA बफर में कोशिकाओं को बद्ध किया गया और संपूर्ण कोशिकाओं के उद्धरण तैयार किए गए। नमूने -20 °C पर संग्रहीत किए गए थे।

1.

जैसा कि पहले बताया गया है, डबल टिमिडीन ब्लॉक (डीटीबी) द्वारा K562 कोशिकाओं को जी1/एस चरण में गिरफ्तार किया गया था (देखें प्रथम नमूना प्रोटोकॉल)

2.

कोशिकाओं को केंद्रन द्वारा ५ मिनट के लिए 400 x g पर काटा गया और X 2 को पूर्ण माध्यम में (10 ml) में धोया गया।

3.

कोशिकाओं (1 x 106/ ml) को फिर पूरी तरह से मध्यम में फिर से निलंबित किया गया और 1 घंटे तक आराम करने दिया गया।

4.

कोशिकाओं को या तो वाहन (0,1% (v/v) DMSO) या टैक्सोल (1 µM) 11 h. 12 h के बाद DTB कोशिकाओं को या तो वाहन (0,1% (v/v) DMSO) या किनासे इंबिटर्स, BI2536 (10 µM) रोस्कोविटिन (20 µM), RO-3306 (9 µM), पुरवालानोल A (10 µM) प्रोटोसोम इंबिटोर, MG-132 (10 µM) 2 घंटे के लिए.

5.

कोशिकाओं को RIPA बफर से लिस्ड किया गया और पूरी कोशिकाओं के उद्धरण तैयार किए गए।

6.

नमूने -20 °C पर संग्रहीत किए गए थे।

1.

कोशिकाओं (1 x 10 ⁶) को 12 घंटे के लिए या तो वाहन (0,1% (v/v) डीएमएसओ), टैक्सोल (1 µM) या नोकोडाज़ोल (1 µM) से उपचारित किया गया था।

2.

कोशिकाओं को दो घंटे के लिए किनाज इंबिटोर रोस्कोविटिन (20 µM) या रोस्कोविटिन और प्रोटोसोम इंबिटोर, MG-132 (10 µM) से उपचार किया गया. कोशिकाओं को केंद्रन द्वारा 400 x g पर 5 मिनट के लिए पकड़ा गया और 30 µl रिपा बफर से लीज किया गया।

3.

नमूने -20 °C पर संग्रहीत किए गए थे।

1.

K562 कोशिकाओं को 18 घंटे के लिए या तो वाहन (0,1% (v/v) DMSO) या RO-3306 (9 µM) से उपचारित किया गया था.

2.

कोशिकाओं को पूरी तरह से मध्यम रूप में धोने के लिए X 3 में और 10 मि.ली. का संपूर्ण माध्यम को या तो वाहन (0,1% (v/v) DMSO) या MG-132 (10 µM) से फिर से प्लाट किया गया।

3.

नमूने, 0, 15, 30, 45, 60 और 90 मिनट धोने के बाद निकाले गए।

4.

कK562 कोशिकाओं को RIPA बफर से लिस्ड किया गया तथा संपूर्ण कोशिकाओं के उद्धरण तैयार किए गए।

5.

नमूने -20 °C पर संग्रहीत किए गए थे।

1.

अपनी कोशिकाओं को 70 % इथेनॉल में स्थिर और व्याप्त करें

2.

40 µg/ml प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ दागना, और आरएनएज की 25 µg/ml शामिल करें (आरएनए को गिराने के लिए और सुनिश्चित करें कि आप डीएनए पर केवल दाग धोने के लिए).

3.

प्रवाह साइटॉमीटर पर अपने नमूनों को चलाएं।