फ़्लो साइटॉमेट्री प्रोटोकॉल | 10 संकेत और सलाह

फ़्लो साइटॉमेट्री एक तरल धारा में रहते हुए कोशिकाओं के गुणों को मापता है। यह जटिल कोशिका प्रणालियों (जैसे रक्त) का एक कोशिका विश्लेषण बहुत तेजी से (100 सेल्स प्रति सेकंड) करने देता है यह आपको विभिन्न कोशिका गुणों जैसे आकार, ग्रेनुलरता, फ्लोरोसेंस तीव्रता प्रति कोशिका पर देखने की अनुमति देता है।

फ़्लो साइटॉमेट्री को कोशिकाओं की गिनती, कोशिका छांटने, बायोमार्कर का पता लगाने और प्रोटीन इंजीनियरी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कोशिका के अवयव फ्लोरोसेंस तरीके से लेबल किए जाते हैं और फिर लेजर द्वारा विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश का उत्सर्जन करने के लिए उत्साहित किया जाता है। फ़्लो साइटॉमेट्री परिणाम आपको सही रूप से पता लगाने में मदद करते हैं कि कौन सी कोशिकाएं सक्रिय की गई हैं या यदि कई रास्ते सक्रिय किए जा रहे हैं |

फ़्लो साइटॉमेट्री में आप जो दो पैरामीटर चुन सकते हैं उनका उदाहरण है अग्रिम स्कैटर (FSC) और किनारे की स्कैटर चैनल (SSC). एफएससी की तीव्रता कण आकार के साथ संबंधित है और यह जीवित कोशिकाओं से सेलुलर मलबे को पहचानने के लिए प्रयोग किया जा सकता है. एसएससी कण के ग्रेनुलर तत्व के बारे में जानकारी देता है. एफएससी और एसएससी प्रत्येक कण के लिए अद्वितीय हैं और विभिन्न कोशिका प्रकारों को पहचानने के लिए इस्तेमाल किए जा सकते हैं।

नीचे फ्लो साइटॉमेट्री प्रयोगों के लिए कुछ सुझाव और सुझाव के अलावा 2 नमूना प्रवाह साइटॉमिति प्रोटोकॉल हैं|

फ्लो साइटॉमेट्री नमूना फिक्सेशन के लिए यह प्रोटोकॉल सेल साइकिल विश्लेषण और डीएनए लेबलिंग के लिए तैयार करने का एक त्वरित प्रोटोकॉल है। यह प्रोटोकॉल आपको सेल साइकिल, जी1, एस और जी2/एम के चरण को मापने में मदद करेगा जब प्रोपिडियम आयोडाइड से रंगा जाता है।

1. उपचारित नमूनों से के562 कोशिकाओं को 270 x g पर केंद्रन द्वारा 5 मिनट के लिए पकाना ताकि कोशिकाओं को पैलेट किया जा सके
2. गुटिका को परेशान किए बिना सुपरनैंट को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करो।
3. पैलेट को आइसकोल्ड फोस्फेट बफर की गई नमक से धोएं (पीबीएस)
4. सेंटीरिफ्यूज 270 x g 5 मिनट के लिए.
5. पीबीएस के 200 µl में कक्षों को फिर से निलंबित करें
6. नमूना विश्लेषण से रात भर 4 °C पर ऊष्मायन से पहले बर्फ से ठंडे इथेनॉल (70% (v/v)) को 2 मि.ली. में जोड़ें।

1. सेंटीरिफ्यूज स्थिर नमूने 270 x g 5 मिनट के लिए.
2. एथानोल को एस्पिरेट करें और प्बीएस के 500 µl में फिर से निलंबित करें
3. आरनेज ए (30 mg/ ml) और प्रोपिडियम आयोडाइड (300 µM) को जोड़ें और मिश्रित करें।
4. विश्लेषण से पहले 30 मिनट के लिए 37 °C पर नमूनों को अंधेरे में घुलना।
5. सेल साइकिल प्रोफ़ाइल को COULTER© EPICS© XL-MCL प्रवाह साइटॉमीटर का उपयोग करके विश्लेषित किया गया था.

इस प्रोटोकॉल फ्लो साइटॉमेट्री का प्रयोग रिसेक्टरों की कोशिका सतह अभिव्यक्ति पर विशेष उपचार के प्रभावों को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जैसे कि CXCR4.

यह आपके प्रयोग की शुरुआत है और सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है। सुनिश्चित करें कि नमूना तैयारी पूरी तरह से अनुकूल या ऊतकों से निर्मित कोशिकाओं का उपयोग किया जा रहा है। यदि कोशिकाओं को सही ढंग से काटा नहीं जाता है तो इससे कोशिकाओं की व्यवहारिता कम हो सकती है। इसके अलावा, किसी भी एंजाइमेटिक प्रक्रिया का अध्ययन किए जा रहे मार्करों की अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं होना चाहिए।

सभी प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए सभी स्थिरीकरण और व्याप्ति समाधान काम नहीं करते और प्रतिजन की जांच के अनुसार बदल सकते हैं।

अपने फ्ल्युओरोक्रोम का चयन करने से पहले यह आवश्यक है कि आप लेजर, फिल्टर और फ्ल्युओरोक्रोम के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के लक्षणों के बारे में जानते हों. आप जिस उपकरण का उपयोग कर रहे हैं उसकी क्षमताओं को आप जानते हैं. अपनी क्षमताओं में कोई भी दो साइट्रोमीटर एक जैसे नहीं हैं। यदि आपके पास फ्लो साइटोमेट्री कोर है जिसके पास जानकार कर्मचारी हैं, तो उनसे पूछें कि उनका पसंदीदा 4 या 5 या 6 रंग पैनल क्या है. उन्हें आपको यह बताने में भी सक्षम होना चाहिए कि किसी उपकरण पर कुछ रंगों की सीमाएं क्या हो सकती हैं। उच्च घनत्व पर अभिव्यक्त एंटीजेन्स का पता लगाने के लिए हमेशा एक चमकीला फ्लोरोक्रोम चुनें, और मंद फ्लोरोक्रोम एन्टीजेन्स का पता लगाने के लिए जो उच्च घनत्व पर अभिव्यक्त होते हैं। फ्लोरोक्रोम का चुनाव मुआवजे के लिए भी महत्वपूर्ण है, और यह भी विचार किया जाना चाहिए कि 'मल' फ्लोरोक्रोम स्पेक्ट्रल ओवरलैप से समस्या पैदा कर सकते हैं।

सभी प्रयोगों की तरह नियंत्रण का चयन महत्वपूर्ण होता है क्योंकि यह अंततः आपको यह निर्धारित करने की अनुमति देता है कि आपका परीक्षण सही ढंग से काम कर रहा है या नहीं और यह आपके परिणाम का एक आवश्यक हिस्सा है. आपके वर्कफ़्लो में निम्न प्रकार के नियंत्रणों को शामिल करने की अनुशंसा की जाती है:

1. यंत्र की गति बढ़ने और मुआवजे को ठीक से समायोजित करने के लिए सेटअप या उपकरण नियंत्रक
2. गेटिंग नियंत्रण, गैर विशिष्ट बाइंडिंग से विशिष्ट को पहचानने के लिए इस्तेमाल किया जाता है
3. जैविक सार्थक जानकारी प्रदान करने के लिए प्रयोगात्मक नियंत्रण

नीचे दी गयी तालिका में उपरोक्त तीनों श्रेणियों के लिए उपयुक्त नियंत्रण सूचीबद्ध है:

यदि संभव हो तो मृत कोशिकाओं के पहचान और उन्मूलन से कोई विशिष्ट दाग कम करने में मदद मिल सकती है। मृत कोशिकाओं को डीएनए रंग के उपयोग से पता लगाया जा सकता है जो झिल्ली अखंडता के नुकसान के साथ कोशिकाओं में प्रवेश करता है।

दोगुना तब होता है जब दो कोशिकाएं एक साथ चिपक जाती हैं और एक के रूप में विश्लेषित की जाती हैं। यह गलत तरीके से लेजर पूछताछ बिंदु के माध्यम से गुजर रहे 'सेल' की फ्लोरोसेंस तीव्रता को बढ़ा देगा। अग्रेषित स्कैटर INT बना कर फ्लाइट का समय (ToF) या साइड स्कैटर INT व साइड स्कैटर टाइम- ऑफ- फ्लाइट (ToF) का उपयोग करके एक विंडो को गेट आउट करें. इसके बाद, कोशिकाओं के गुच्छे को अलग करने के लिए उनका विश्लेषण करने से पहले कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।

एक आदर्श दुनिया में नमूनों का तुरंत विश्लेषण किया जाना चाहिए हालांकि यह हमेशा होता नहीं है। यदि आप अपने नमूनों का तुरंत विश्लेषण नहीं कर पाते हैं तो 100 µl स्थिर (उदाहरण के लिए 1-2% फ़ॉर्मल्डिहाइड) में फिर से निलंबित करें और 4°C पर, 24 घंटे तक प्रकाश से सुरक्षित रखें।

फ्लो साइटोमेट्री प्रयोगों के अनुकूलन के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम है रीअजेंट (एंटीबाडी) टाइटरेशन. यह आपकी पृष्ठभूमि को कम करते हुए फ्लोरोसेंट सिग्नल की विशिष्टता और तीव्रता को बेहतर बनाने में मदद करेगा।

फ्लो सीटॉमिती प्रयोगों के अनुकूलन के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम है रीअजेंट (एंटीबाडी) टाइटरेशन. यह आपकी पृष्ठभूमि को कम करते हुए फ्लोरोसेंट सिग्नल की विशिष्टता और तीव्रता को बेहतर बनाने में मदद करेगा।

आसपास के प्रकाश से फ्लोराक्रोम की क्षति को रोकने के लिए, जिसमें किमती या दाग होने की प्रक्रिया में हैं या जिन्हें रंग दिया गया है, प्लेट या ट्यूब को पन्ने या अन्य प्रकाश अवरोधक तंत्र से नमूनों को कवर करके सुरक्षित किया जाना चाहिए